Design of antigen synthesis and preparation and characterization of specific and eurytopic antibodies against B-group aflatoxins

Abstract

The aim of this study was to prepare B-group aflatoxins(BGAFs) antibody with strong specificity and good eurytopicity. Ac-cording to the molecular structure and active site of aflatoxin B1 (AFB1), the BGAFs artificial antigen AFB1-BSA was prepared by 6 methods such as oxime active ester(OAE) methylation of ammonia(MOA) mixed anhydride(MA) semi acetal(SA) epoxide(EP) and enol ether derivative(EED) and identified by UV and SDS-PAGE. Polyclonal antibodies against AFB1(AFB1 pAb) were prepared by immunizing New Zealand rabbits with AFB1-BSA, and the titers of AFB1 pAb was detected by indirect ELISA, the sensitivity of AFB1 pAb was analyzed by indirect competitive ELISA(icELISA) and the specificity and eurytopicity of AFB1 pAb was analyzed by cross-reactivity(CR) test. The results showed that AFB1-BSA was synthesized successfully and the best one was OAE method among 6 synthesis methods of BGAFs artificial antigen and its conjugation ratio of AFB1 to BSA was about 8.46∶1. The immune efficacy of OAE method was the best, its AFB1 pAb had high titers of 1∶ 1.28×104 by indirect ELISA, a good sensitivity with the 50% inhibition concentration(IC50) of 10.32 μg/L to AFB1 by icELISA and a high CR to AFB2 of 75.21%, AFG1 of 44.13%, AFG2 of 14.72%, AFM1 of 16.36% and AFM2 of 1.44%, respectively. In this study, AFB1 pAbs with high titer, sensitivity, specificity and eurytopicity were pre-pared, which laid a matter and technical foundation for the establishment of BGAFs immunoassay. Метою цього дослідження було вироблення антитіл до афлатоксинів групи В (BGAF) із сильною специфічністю та хорошою евритопічністю. Дослідження проводили в лабораторії безпеки та якості продуктів тваринництва Сумського НАУ, факультету ветеринарної медицини, Суми, Україна та на базі Науково-технічного інституту Хенань, Сіньсян, Китай. Відповідно до молекулярної структури та активного центру афлатоксину B1 (AFB1), штучний антиген BGAFs AFB1-BSAготували 6 ма методами, такими як метод активного ефіру оксиму (OAE), метилювання аміаку (MOA), зміша-ний ангідрид (MA), напівфабрикат ацеталь (SA) епоксид (EP) та похідне енолового ефіру (EED) та ідентифікували за допомогою УФ та SDS-PAGE. Поліклональні антитіла проти AFB1 (AFB1 pAb) готували шляхом імунізації новозеландських кролів AFB1-BSA, а титри AFB1 pAb виявляли за допомогою непрямого ІФА, чутливість AFB1 pAb аналізували за допомогою непрямого конкурентного ІФА (icELISA), специфічність та еурітопічність AFB1 pAb аналізували за допомогою тесту перехресної реактивності (CR). Результати показали, що AFB1-BSA був успішно синтезований, і найкращим був метод активного ефіру оксиму (OAE) із 6 методів синтезу штучного антигену BGAF, а його відношення кон'югації AFB1 до BSA становило близько 8,46À1. Імунна ефективність методу OAE була найкращою, його pAb AFB1 мав високі титри 1∶ (1,28×104) з використанням методу непрямого ІФА, чутливість з 50% концентрацією інгібування (IC50) 10,32 мкг / л до AFB1 за допомогою icELISAта високий CR до AFB2 75,21%, AFG1 44,13%, AFG2 14,72%, AFM1 16,36% та AFM2 1,44% відповідно. У цьому дослідженні були підготовлені pAbs AFB1 з високим титром, чутливістю, специфічністю та еуритопічністю, що заклало важливу та технічну основу для створення імунологічного аналізу BGAF.