Biological Control of Distrbution Grapholita molesta Thtrough Immunological Features

Cao, Zhishan; Цао, Чжишань

Biological Control of Distrbution Grapholita molesta Thtrough Immunological Features

Cao, Zhishan; Цао, Чжишань

URI: https://repo.snau.edu.ua:8080/xmlui/handle/123456789/11240

Дата: 2023

Короткий опис(реферат):

The oriental fruit moth, Grapholita molesta (Busck) is a key pest of tree fruit of Europe, Asia, America, Africa, Australia, and New Zealand, which makes a big damage to apple trees, pear tree and the stone fruit of the peach, plum, apricot, nectarine, cherry and so on. The hidden damage of larvae makes their prevention and control difficult and traditional chemical method is rarely effective. Meanwhile with the increasing demand for food safety and awareness of environmental protection, biological control method to this pest has attracted more and more people's attentions. Beauveria bassiana is one of the most widely studied and used entomopathogenic fungi, which can also infect and kill the oriental fruit moth as a biological control agent. The entomopathogenic fungi with a wide range host and they are harmless to the environment, human and animal. Using entomopathogenic fungi to control pests has many advantages and it has been an important part in biological control of pests. However, entomopathogenic fungi as a better alternate control method still with some disadvantages, such as easy to be affected by environmental conditions. In order to make good use of entomopathogenic fungi in the future, it is necessary to deeply understand their living conditions and infection mechanism to insects. Entomopathogenic fungi can invades the insects from the body wall through contact directly, but also can through the digestive tract, stomata and wounds and other ways into the insect body. But insects have evolved a strong innate immune system to protect themselves from infection by the pathogens and adverse conditions. When insects are infected by entomopathogenic fungi, their innate immune system will firstly be activated. And the insects will resist the infection by their immune response, which will lead to the reduction of infection efficiency and the control effect. So, it is necessary to study the immune response of insects introduced by entomopathogenic fungi, and it has been a study hotspot in pest control. The immune ability of insects to entomopathogenic fungi directly affects the infection efficiency, which is an area of active research in the field of entomopathogenic fungi currently. In this paper, the optimal concentration and infection mode of B. bassiana on G. molesta larvae were selected under laboratory conditions. Secondly, the transcriptome of G. molesta after infected by B. bassiana were analyzed，and the immune-related genes of G. molesta larva against B. bassiana were screened out. Thirdly, the peptidoglycan recognition proteins (GmPGRP-SC), β-1,3-glucan recognition proteins (GmBGRP) and serine protease inhibitor genes (GmSerpin-2 and GmSerpin-3) involved G. molesta larva in immune response were identified by molecular methods. We carried out phylogenetic analysis based on amino acid sequences to identify homologous protein in G. molesta belonging to the same clade as that encoding the target proteins. The spatio-temporal expression patterns of the selected target genes in the larva of G. molesta after infection with B. bassiana were assessed by qPCR. Moreover, we used nanoparticles mediation the GmSerpin-2 and GmSerpin-3 genes, which effectively increasing the interference efficiency of RNAi. Finally, we have a good grasp of the occurrence rule of oriental fruit moth in Xinxiang area by investigation of the damage of adult and larva in peach orchard. Meanwhile, the field efficacy test of five different biological pesticides showed that Bt, Spinetoram, Methoxyfenozide, Celastrus angulatus MaXim and B. bassiana all have better control effect on oriental fruit moth. But the control effect of Bt and B. bassiana are relatively lower than other three agents. We need to do more future research to improve their effectiveness. This study laid a foundation for the exploration of new biological control targets of G. molesta IPM system and the enhancement of B. bassiana for effectively biological control. The main results and conclusions are as follows: Laboratory Evaluation of the effect of B. bassiana on the vital activity of G. molesta: G. molesta infected by B. bassiana through cuticular infection had higher corrected mortality and better weight inhibition than that of digestive tract infection. Meanwhile, B. bassiana at concentration of 1×107 conidia/mL may have potential to be used as control measure against G. molesta in fruit orchards. Transcriptome analysis of G. molesta larvae 24 h after infected by B. bassiana: The second-generation high-throughput transcriptome sequencing technology were used, the transcriptomic profile of G. molesta larva infected by B. bassiana after 24 h were analyzed, the differentially expressed genes (DEGs) were screened and annotated. Totally, 1,755 DEGs were obtained, with 965 up-regulated and 790 down-regulated genes. The fold change (log2 ratio) of the gene expression ranged from -14.224 to 10.718. We focused on the up-regulated genes in G. molesta infected by B. bassiana, and 14 genes related to immune response of G. molesta induced by B. bassiana were selected and quantified by qRT-PCR method, and 10 genes were significantly up-regulated. Finally, 1,755 DEGs were enriched in 1,965 GO terms, among which 107 GO terms were significantly enriched, including 62 Biological processes, 7 Cellular components and 38 Molecular functions. These results indicated the G. molesta has changed its physiological and biochemical state as defense responses against B. bassiana. Characterization and functional analysis of Immune recognition gene GmPGRP-SC, GmBGRP, GmSerpin-2 and GmSerpin-3: The complete sequence of GmPGRP-SC gene, GmBGRP, GmSerpin-2 and GmSerpin-3 are obtained and characterized. They have been submitted to NBCI GenBank respectively, and the GenBank accession number is MW773839, ON055286, OQ359960 and OQ35996. The gene sequences, structures, physical and chemical properties were analyzed. To explore the spatio-temporal expression patterns of each gene, the qPCR data form different tissues and developmental stages were analyzed, besides we analyzed the specific functions of each gene. In order to better understand the molecular interaction mechanism between B. bassiana and G. molesta, the effect of B. bassiana on the regulation of immune-related gene expression were analyzed. Finally, we successfully silenced the target gene using RNAi technology, and the effects of target gene silencing on larvae ability to resist fungal infection were analyzed, which laid a good foundation for further improving the control effect of entomopathogenic fungi. In addition, we analyzed the effects of GmBGRP gene silencing on Toll immune signaling pathway related gene expression and PPO enzyme activity. And effectively improve the interference efficiency of GmSerpin-2 and GmSerpin-3 genes mediated by nanoparticles M2L and NP5. Investigation on the occurrence and dynamics of G. molesta in peach orchard and evaluation on the control of five different biological pesticides: According to the survey results in the Xinxiang area, overwintered larva began to pupate in late March, the pupal stage was 10-20 days, and first-generation adult appeared in early April, which reaching a high level around 4, May. Then, the number of G. molesta began to increase continuously with the rise of temperature. The occurrence of male adult G. molesta in Xinxiang has no obvious rule, and with serious overlap generations. There is no obvious boundary between each generation, especially between the 2~3 generation and 3~4 generation. Larvae of oriental fruit moth had boring into the peach shoots from April 18. Meanwhile the larvae have transferring harm habit to peach shoot. The middle May is the key time for controlling of G. molesta in Xinxiang area. The damaged peach shoots can be cut off manually and taken out of the orchard for centralized destruction in order to reduce the occurrence of overwintering generation. The damaged shoots rate by G. molesta in peach orchard was higher than that in nectarine orchard. And in the same peach orchard, the damaged shoots are also different due to different planting densities. The shoots damage is higher with planting density of 4×4 meters than that with planting density of 3×3 meters. The five biological agents all had adverse effects on the growth of peach trees. The results of this study indicating that all the five biological agents were safe for the growth of peach trees. And the 5 biological control agents all have certain control effects on G. molesta. On day 7 in treatment groups, the control effec of the five agents was 56.3% ~ 86.4%. Its control effect was 63.1% ~ 80.1% on day 14 of treatment. Among them, 60 g/L pinetoram suspension 2000 times liquid and 240 g/L Methoxyfenozide suspension 5 000 times liquid have better control effectiveness with 86.4% and 74.6% control effect on day 7 in the treatment groups. Moreover, the control effect of these two agents was still more than 78% on day 14. The control effects of 0.2% Celastrus angulatus MaXim and 10 billion spores B. bassiana were 68.25% and 66.8% respectively on day 7 in treatment groups, and the control effects of these two agents were 61.27% and 67.1% on day 14 in treatment groups which indicating that the two agents had relatively good quick and lasting effect on the control of G. molesta. In summary, all these results lay a foundation for better understanding of the immune mechanism between entomopathogenic fungi and insects, and effectively improve the control effect of entomopathogenic fungi, which lay a solid foundation for the biological control of G. molesta pests. Moreover, the study of immune-related genes, in order to find more suitable target genes, which can also be applied to the development of other biological control agents and improve their control effect. The results providing strong support for better biological control through immune characters of oriental fruit moth.

Суть розробки, основні результати:

Східна плодова плодожерка, Grapholita molesta (Busck) є основним шкідником плодових дерев у Європі, Азії, Америці, Африці, Австралії та Новій Зеландії, який завдає великої шкоди яблуні, груші та кісточковим плодам персика, сливи, абрикоса, нектарина, вишні тощо. Прихована шкода личинок ускладнює профілактику та боротьбу з ними, а традиційні хімічні методи рідко бувають ефективними. Тим часом, зі зростанням попиту на безпеку харчових продуктів та усвідомленням важливості захисту навколишнього середовища, біологічний метод боротьби з цим шкідником привертає все більше уваги. Beauveria bassiana є одним з найбільш широко вивчених і використовуваних ентомопатогенних грибів, який також може заражати і знищувати Grapholita molesta в якості агента біологічного контролю. Ентомопатогенні гриби мають широкий спектр господарів і є нешкідливими для навколишнього середовища, людей і тварин. Використання ентомопатогенних грибів для боротьби зі шкідниками має багато переваг і є важливою частиною біологічного контролю шкідників. Однак ентомопатогенні гриби як кращий альтернативний метод боротьби все ще мають деякі недоліки, наприклад, вони легко піддаються впливу умов навколишнього середовища. Для того, щоб ефективно використовувати ентомопатогенні гриби в майбутньому, необхідно детально вивчити умови їхнього існування та механізм зараження комах-шкідників. Ентомопатогенні гриби можуть проникати в організм комах зі стінок тіла безпосередньо через контакт, а також через травний тракт, продихи, рани та інші шляхи. Але комахи мають розвинену вроджену імунну систему, яка їм допомагає захистити себе від зараження патогенами та підвищує стійкість до несприятливих умов існування. Коли комахи заражаються ентомопатогенними грибами, їхня вроджена імунна система активується і комахи протистоять інфекції, що призводить до зниження ефективності інфекції та ефекту контролю над чисельністю шкідників та пошкодженістю рослин. Таким чином, необхідно вивчати імунну реакцію шкідника зараженого ентомопатогенними грибами, що є актуальним напрямком досліджень у боротьбі зі шкідниками. Імунна здатність Grapholita Molesta до ентомопатогенних грибів безпосередньо впливає на ефективність зараження, що є сферою активних досліджень, на сьогодні, особливо в захисті і карантині рослин. У цій роботі в лабораторних умовах підібрано оптимальну концентрацію та режим зараження личинок G. Molesta біологічно-активними речовинами ентомопатогенних грибів (B. bassiana). По-друге, проаналізовано транскриптом G. molesta після зараження B. bassiana та проведено скринінг генів, пов'язаних з імунітетом личинок G. molesta проти B. bassiana. По-третє, молекулярними методами ідентифіковано гени пептидогліканових білків (GmPGRP-SC), β-1,3-глюканових білків (GmBGRP) та інгібіторів серинових протеаз (GmSerpin-2 та GmSerpin-3), які залучені до імунітету личинки G. molesta. Проведено філогенетичний аналіз на основі амінокислотних послідовностей для виявлення гомологічних білків у G. molesta, що належать до тієїж категорії, що й білки-мішені. Просторово-часові параметри експресії обраних генів-мішеней у личинках G. molesta після зараження B. bassiana оцінювали за допомогою qPCR. Крім того, ми використовували наночастинки, що опосередковують гени GmSerpin-2 і GmSerpin-3, які ефективно підвищують інтерференційну ефективність РНКі. Було визначено стресогенні фактори, які впливають на закономірність появи та розвитку Grapholita molesta в районі Сіньсян, досліджуючи морфологію пошкодження імаго та личинок у персиковому саду. Тим часом, польові випробування ефективності різних біологічних пестицидів показали, що Bt, Spinetoram, Methoxyfenozide, Celastrus Angulatus MaXim і B. Bassiana мають кращий контроль над Grapholita molesta. Але контрольний ефект Bt та B. Bassiana є відносно нижчим, ніж у деяких препаратів. Це дослідження заклало основу для вивчення нових біологічно активних речовин, актиноміцетів, які зменшать чисельність/контролюватимуть поширення G. molesta в системі захисту рослин. Окрім того нами розроблена система вдосконалення застосування B. Bassiana для ефективного біологічного контролю. У результаті лабораторної оцінки впливу B. bassiana на життєдіяльність G. molesta досліджень було виявлено: G. molesta, які заражені B. bassiana через кутикулярну інфекцію, мали вищу смертність та зниження маси, ніж при інфікуванні травного тракту. B. bassiana в концентрації 1×107 конідій/мл може потенційно використовуватися як засіб боротьби з G. molesta у плодових та ягідних садах. Транскриптомний аналіз личинок G. molesta через 24 год після зараження B. bassiana: за допомогою високопродуктивної технології секвенування транскриптома другого покоління проаналізовано транскриптомний профіль личинок G. molesta, інфікованих B. bassiana через 24 год, проведено скринінг та анотацію диференційовано експресованих генів (DEGs). Загалом було отримано 1,755 DEGs, з яких 965 – висхідні та 790 – низхідні гени. Коефіцієнт зміни експресії генів (log2) варіював від -14,224 до 10,718. Ми зосередилися на підвищеній регуляції генів у G. molesta, інфікованих B. bassiana, і відібрали 14 генів, пов'язаних з імунною реакцією G. molesta, індукованою B. bassiana, та кількісно оцінили їх за допомогою методу qRT-PCR, причому 10 генів виявилися значно підвищеною регуляцією. Нарешті, 1 755 DEGs були збагачені в 1 965 термінах GO, серед яких 107 термінів GO були значно збагачені, включаючи 62 біологічні процеси, 7 клітинних компонентів і 38 молекулярних функцій. Що свідчить, що G. molesta змінила свій фізіологічний та біохімічний стан, морфологію як захисну реакцію проти B. bassiana. Отримано та охарактеризовано повну послідовність генів GmPGRP-SC, GmBGRP, GmSerpin-2 та GmSerpin-3. Вони були передані до NBCI GenBank відповідно з номерами доступу MW773839, ON055286, OQ359960 та OQ35996. Під час вивчення просторово-часових пар експресії кожного гена були проаналізовані дані qPCR з різних тканин і стадій розвитку, а також проаналізовані специфічні функції кожного гена. Для того, щоб краще зрозуміти механізм молекулярної взаємодії між B. bassiana та G. molesta, було проаналізовано вплив B. bassiana на регуляцію експресії генів, пов'язаних з імунітетом. Було успішно знижено імунітет шкідника за допомогою технології РНКі та проаналізовано вплив знижеження імунності личинок проти грибкової інфекції, що заклало хороший фундамент для подальшого покращення ефекту контролю ентомопатогенних грибів. Крім того, було проаналізовано вплив пригнічення гена GmBGRP на експресію генів, пов'язаних з імунною реакцією шляхом Toll, та активність ферменту PPO. А також підвищено ефективність інтерференції генів GmSerpin-2 та GmSerpin-3 за допомогою наночастинок M2L та NP5. Досліджено поширення та динаміки G. Molesta в персиковому саду в районі Сіньсян та визначено ефективність різних біологічних пестицидів. Личинка, що перезимувала, почала заляльковуватися в кінці березня, стадія лялечки тривала 10-20 днів, а імаго першого покоління з'явилися на початку квітня, досягнувши максимумуи близько 4 травня. Після цього чисельність G. molesta почала безперервно зростати з підвищенням температури. Поява імаго G. molesta в Сіньсяні не має чіткої закономірності, що зумовлено серйозним перекриттям поколінь. Не виявлено чіткої межі між кожним поколінням, особливо між 2~3 поколінням і 3~4 поколінням. Личинки G. molesta вгризалися в пагони персика з 18 квітня. Середина травня виявилася основним періодом для боротьби з G. molesta в регіоні Сіньсян. Пошкоджені пагони персика потрібно зрізати і вивозити з саду для централізованого знищення зимуючого покоління. Відсоток пошкоджених пагонів G. molesta у персиковому саду був вищим, ніж у нектариновому. Разом з тим, в одному і тому ж персиковому саду, пошкодженість пагонів відрізнялися в залежності від густоти насаджень. Пошкодження пагонів спостерігалася вище при щільності насаджень 4×4 метри, ніж при щільності насаджень 3×3 метри. Всі досліджувані біологічні агенти не мали негативного впливу на ріст персикових дерев, що свідчить про те, що всі п'ять біологічних агентів були безпечними для росту персикових дерев та мали позитивний ефект над контролем заселення і поширення G. Molesta. На 7-й день у досліджуваних групах контрольний ефект препаратів становив 56,3% ~ 86,4%. На 14-й день захисту контрольний ефект становив 63,1% ~ 80,1%. Серед них суспензія пінетораму 60 г/л, розведена у 2000 л. розчину, та суспензія метоксифенозиду 240 г/л, розведена у 5000 л. розчину, мали кращу контрольну ефективність - 86,4% та 74,6% на 7-й день після застосування. Більше того, контрольний ефект цих двох препаратів перевищував 78% на 14-й день. Контрольний ефект 0,2% Celastrus angulatus MaXim та 10 мільярдів спор B. bassiana становив 68,25% та 66,8% відповідно на 7-й день у групах захисту, а контрольний ефект цих двох препаратів становив 61,27% та 67,1% на 14-й день у групах захисту, що вказує на те, що ці два препарати мали відносно хороший швидкий та тривалий ефект для контролю шкідника – G. molesta. Таким чином, результати досліджень розкривають основні моменти імунного механізму між ентомопатогенними грибами та шкідниками, а також вказують на ефективність контролю ентомопатогенних грибів проти G. molesta, що сприятиме розвитку біологічного захисту плодових насаджень. Крім того, нами досліджено гени, які знижують резистентність (стійкість) шкідників, з метою пошуку більш активних генів-мішеней, які також будуть застосовані для розробки інших агентів біологічного контролю та покращення їхнього контрольного ефекту. Отримані результати є вагомим внеском в розвиток біологічного контролю шкідників саду.

Показати повний опис матеріалу