Multiplex PCR assay based on the citE2 gene and intergenic sequence for the rapid detection of Salmonella Pullorum in chickens

Abstract

Salmonella is one of the most common Gram-negative pathogens and seriously threatens chicken farms and food safety. This study aimed to establish a multiplex polymerase chain reaction (PCR) approach for the identification of different Salmonella enterica subsp. enterica. The citE2 gene and interval sequence of SPS4_00301–SPS4_00311 existed in all S. enterica subsp. enterica serovars by genomic comparison. By contrast, a 76 bp deletion in citE2 was found only in Salmonella Pullorum. Two pairs of special primers designed from citE2 and interval sequence were used to establish the multiplex PCR system. The optimized multiplex PCR system could distinguish Salmonella Pullorum and non-Salmonella Pullorum. The sensitivity of the optimized multiplex PCR system could be as low as 6.25 pg/μL and 104 colony-forming units (CFU)/mL for genomic DNA and Salmonella Pullorum cells, respectively. The developed multiplex PCR assay distinguished Salmonella Pullorum from 33 different Salmonella enterica subsp. enterica serotypes and 13 non-target species. The detection of egg samples artificially contaminated with Salmonella Pullorum, Salmonella Enteritidis and naturally contaminated 69 anal swab samples showed that results were consistent with the culture method. These features indicated that the developed multiplex PCR system had high sensitivity and specificity and could be used for the accurate detection of Salmonella Pullorum in clinical samples. Сальмонела є одним з найпоширеніших грамнегативних патогенів і серйозно загрожує курячим фермам і безпеці харчових продуктів. Це дослідження було спрямоване на встановлення підходу мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для ідентифікації різних видів Salmonella enterica. enterica. Ген citE2 та інтервальна послідовність SPS4_00301–SPS4_00311 існували у всіх підвид S. enterica. серовари enterica шляхом геномного порівняння. Навпаки, делеція 76 bp у citE2 була виявлена лише у Salmonella Pullorum. Для створення системи мультиплексної ПЛР використовували дві пари спеціальних праймерів, сконструйованих із citE2 та інтервальної послідовності. Оптимізована мультиплексна ПЛР-система могла відрізнити Salmonella Pullorum і не Salmonella Pullorum. Чутливість оптимізованої системи мультиплексної ПЛР може становити 6,25 пг/мкл і 104 колонієутворюючі одиниці (КУО)/мл для геномної ДНК і клітин Salmonella Pullorum відповідно. Розроблений мультиплексний ПЛР-аналіз відрізняє Salmonella Pullorum від 33 різних видів Salmonella enterica. серотипів enterica та 13 нецільових видів. Виявлення зразків яєць, штучно забруднених Salmonella Pullorum, Salmonella Enteritidis та природно забруднених 69 зразків анального мазка, показало, що результати відповідали методу культивування. Ці особливості свідчать про те, що розроблена мультиплексна ПЛР-система мала високу чутливість і специфічність і може бути використана для точного виявлення Salmonella Pullorum у клінічних зразках.