Advances in research on mechanism and function of antimicrobial peptides

Xueqin, Zhao; Сюєцінь, Чжао

Advances in research on mechanism and function of antimicrobial peptides

Xueqin, Zhao; Сюєцінь, Чжао

URI: https://repo.snau.edu.ua:8080/xmlui/handle/123456789/10179

Date: 2022

Abstract:

Description:

In the dissertation work on the basis of research are substantiated the bactericidal mechanism, barrier protection, anti-inflammatory effect and the relationship between the anti-inflammatory effect and intestinal flora of antimicrobial peptide to develop and applicant drugs for prevention inflammation, maintain intestinal flora balance and improve growth performance. Though antibiotics have good antibacterial and anti-inflammatory effects, they may damage the intestinal barrier function, disrupt the intestinal microbial balance, and disrupt the body's intestinal homeostasis. The problems caused by the long-term large-scale use of antibiotics are becoming more and more serious, and the development of efficient and safe antibiotic substitutes is imminent. Antimicrobial peptides have attracted attention due to their broad-spectrum antimicrobial activity, not have drug resistance, and extensive biological functions. During our resserch we investigated mechanism of the antimicrobial peptide mastoparan X in killing Gram-negative bacteria in vitro and its anti-inflammatory and barrier repair functions in pneumonia and enteritis diseases in vivo, and to further study the relationship between anti-inflammatory and intestinal microbes of MPX. Finally, we explored the anti-inflammatory and barrier repair functions mechanism of MPX in the intestinal epithelial cells, laying a foundation for reducing the use of antibiotics in livestock and poultry breeding, it will help provide certain theoretical and practical value for future applications in livestock and poultry. Our research has found that antimicrobial peptides not only relieve intestinal inflammation, but also have the function of protecting the intestinal barrier. Studies have revealed that MPX had good bactericidal activity in vitro, and the main bactericidal mechanism was to produce bactericidal effect by destroying the integrity of the bacterial cell membrane. MPX had good antibacterial and anti-inflammatory effects in mice. MPX had better effect of killing Actinobacillus pleuropneumoniae and alleviating the symptoms of pneumonia causedby A. pleuropneumoniae which mainly by reducing the level of inflammatory factors to alleviate the symptoms of pneumonia. In addition, the study further found that MPX also could alleviate the intestinal inflammation and barrier function damage infection with E. coli by reducing inflammatory factors and increasing tight junction proteins, and explorethe mechanism of MPX relieve inflammation and maintain intestinal barrier function in intestinal epithelial cells. Finally, the relationship between MPX to relieve intestinal inflammation and intestinal microbes was studied. The results found thatMPX alleviated the intestinal inflammation by changing the diversity of intestinal flora. The results of the studies did not reveal MPX regulate the mechanism of microbial diversity, but intestinal microbial diversity and intestinal flora homeostasis were indeed related to intestinal inflammation, and MPXalleviated the intestinal inflammation was indeed closely related to intestinal flora. A. pleuropneumoniae is the causative agent of highly contagious and fatal respiratory infections, causing substantial economic losses to the global pig industry. Due to increased antibiotic resistance, there is an urgent need to find new antibiotic alternatives for treating A. pleuropneumoniae infections. MPX is obtained from wasp venom and has a killing effect on various bacteria. This study found that MPX had a good killing effect on A.pleuropneumoniae and that the minimum inhibitory concentration (MIC) was 16 µg/mL. The bacterial density of A. pleuropneumoniae decreased 1000 times after MPX (1×MIC) treatment for 1 h, and the antibacterial activity was not affected by pH or temperature. Fluorescence microscopy showed that MPX (1×MIC) destroyed the bacterial cell membrane after treatment for 0.5 h, increasing membrane permeability and releasing bacterial proteins and Ca2+, Na+ and other cations. In addition, MPX (1×MIC) treatment significantly reduced the formation of bacterial biofilms. Quantitative RT-PCR results showed that MPX treatment significantly upregulated the expression of the PurC virulence gene and downregulated that of ApxI, ApxII, and Apa1.In addition, the Sap A gene was found to play an important role in the tolerance of A. pleuropneumoniae to antimicrobial peptides.Therapeutic evaluation in a murine model showed that MPX protects mice from a lethal dose of A. pleuropneumoniae and relieves lung inflammation.This study reports the use of MPX to treat A.pleuropneumonia infections, laying the foundation for the development of new drugs for bacterial infections. Escherichia coli is a facultative anaerobic bacterium that exists in the gastrointestinal tract of humans and animals. It can cause diarrhea, enteritis, destruction of the host's intestinal barrier, and intestinal microecological disturbances. In recent years, due to the abuse of traditional antibiotics, a variety of drug-resistant strains and super bacteria have emerged in an endless stream. Therefore, there is an urgent need to find new alternatives to antibiotics. To explore the effect of MPX against E. coli. The function of MPX against E. coli was detected by MIC, plate count, propidium iodide, NPN and DiSC3(5) permeability testing, immunofluorescence microscope observation, and the impact of MPX stability by temperature, pH, ion. In this study, the results found that MPX has good antibacterial activity against E. coli, and the minimum inhibitory concentration (MIC) was 31.25 ug/mL. MPX bactericidal kinetics study found that MPX had good bactericidal activity within 6 hours. Bacterial permeability studies have shown that MPX could increase the permeability of bacteria, leading to an increase in the protein content of the bacterial supernatant. In addition, NPN, PI and DiSC3(5) results showed that the fluorescence value was positively correlated with MPX. The stability test of MPX found that salt ions, temperature, pH, etc. have a slight influence on its effect. In addition, scanning electron microscopy results showed that the bacteria became smaller and the contents leaked after the action of MPX. The above results showed that MPX has a good bactericidal activity in vitro, laying the foundation for the development of new drugs for the treatment of bacterial infections. To investigate whether theantimicrobial peptide mastoparan X (MPX) was effective against E. coli infection. BALB/c mice infected with E. coli by intraperitoneal injection, which represents a sepsis model. The therapeutic effect of MPX was evaluated in a murine model, revealing that it protected mice from lethal E. coli infection. Furthermore, MPX increased the length of villi and reduced the infiltration of inflammatory cells intothe jejunum. SEM and TEM analyses showed that MPX effectively ameliorated the jejunum damage caused by E. coliand increased the number and length of microvilli. In addition, MPX decreased the expression ofIL-2, IL-6, TNF-α, p-p38 and p-p65in the jejunum and colon. Moreover, MPX increased the expression of ZO-1, occludin and MUC2 in the jejunum and colon, improved the function of the intestinal barrier and promoted the absorption of nutrients. This study suggests that MPX is an effective therapeutic agent for E. coli infection and other intestinal diseases, laying the foundation for the development of new drugs for bacterial infections. We investigated whether the antimicrobial peptide mastoparan X (MPX) was effective against E. coli infection. BALB/c mice infected with E. coli by intraperitoneal injection, which represents a sepsis model. In this study, MPX exhibited no toxicity in IPEC-J2 cells and notably suppressed the levels of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), myeloperoxidase (MPO) and lactate dehydrogenase (LDH) induced by E. coli. In addition, MPX improved the expression of ZO-1, occludin, and claudin and enhanced the wound healing of IPEC-J2 cells. We have proved that antimicrobial peptides can regulate theintestinal flora and maintain intestinal homeostasis. Previous studies have shown that MPXhadgood therapeutic effect on intestinal inflammation caused by E. coli infection. However, the relationship between the alleviation of intestinal inflammation and the intestinal microbiota by MPX is still unknown. We investigated the correlation between theanti-inflammatory effects of MPX and the regulation of the gut microbiota. In this study, E. coliwas used to induce intestinal inflammation, and the results showed that MPX alleviated weight loss and intestinal pathological changes in necropsy specimens ofE. coli-infected mice. MPX reduced the serum levels of the inflammation-related proteins IL-2, IL-6, TNF-α, MPO and LDH on day 7 and day 28. Furthermore, H&E results showed that MPX increased the length of villi and reduced the infiltration of inflammatory cells intothe jejunum and colon. SEM and TEM resultsshowed that MPX could improve the morphology of jejunum villi and microvilli and increase tight junction protein levels. The16S rRNA sequencing analysis of caecalcontent samplesshowed that species diversity and richnesswere lower in the E. coli-infected group. At the phylum and genus levels, higher abundances of pathogenic Firmicutes, Lachnospiraceae-NK4A-136 and Alistipes bacteria were observed. MPX treatment decreased pathogenic bacterial counts in the E. coli-infected group. Furthermore, MPX increased the abundance of Muribaculaceae. Alpha and Beta analysis showed that there was no significant difference inbacterial community structure between the MPX andcontrol groups. In addition, alterations in theintestinal microbiome of miceaffected physiological functions and metabolic pathways. Overall, this study is the first to investigate the correlation of the effects of MPX on intestinal inflammation and the intestinal microbiota, which alleviate intestinal inflammation by restoring the diversity and functions of the gut microbiota, providing a new perspective regarding thetreatment of enteritis. Thus, the findings of these studies were aimed at clarifying MPX had good antibacterial activity against A. pleuropneumoniae and E. coli infectionsin vitro and in vivo. MPXcould resist the pathological damage to the lung and intestine of mice, and relieve the pneumonia, enteritis and intestinal barrierof mice caused bybacteria and further clarify the mechanism of MPX to relieve intestinal inflammation and enhance the intestinal barrier function atintestinal epithelial cells. Finally, this study found that MPX relieved intestinal inflammation by regulating the diversity of intestinal flora. Based on the materials of the dissertation, methodological recommendations «Prevention of antibiotic resistance through the use of antimicrobial peptides» approved by the Academic Council of SNAU (Protocol № 5, dated 29.12.2021). We recommend using the materials of the dissertation work when studying the courses "Veterinary microbiology", "Veterinary pharmacology" for masters of the Faculty of Veterinary Medicine of Sumy NAU. And for the courses "Veterinary microbiology" and "Veterinary pharmacology" for masters of the Henan Institute of Science and Technology (HIST). Чжао Сюєцінь «Удосконалення методів досліджень та функції антимікробних пептидів» – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 211 «Ветеринарна медицина» − Сумський національний аграрний університет, м. Суми, 2022 У дисертаційній роботі, на основі проведених досліджень, обґрунтовано механізм бактерицидної та протизапальної дій, бар’єрний захист, та взаємозв’язок між протизапальною дією та кишковою флорою антимікробного пептиду для подальших розробок препаратів з метою профілактики запалення, підтримки балансу кишкової флори і покращення продуктивність. Незважаючи на те, що антибіотики мають високу антибактеріальну та протизапальну дію, в той же час вони можуть пошкодити функцію кишкового бар’єру, порушити кишковий мікробний баланс і порушити кишковий гомеостаз організму. Також існує проблема виникнення резистентних штамів мікроорганізмів. Проблеми, спричинені тривалим широкомасштабним використанням антибіотиків, стають дедалі серйознішими, а розробка ефективних і безпечних замінників антибіотиків вкрай актуальна і неминуча. Антимікробні пептиди привернули нашу увагу завдяки своїй антимікробній дії широкого спектру, відсутності резистентності та широкими біологічними функціям. Під час дослідження було вивчено механізм антимікробного пептиду мастопаран X його здатність знищувати грам негативні бактерії in vitro та його протизапальну та бар’єрну функції відновлення при пневмонійних та ентеритних захворюваннях in vivo, а також для подальшого вивчення зв’язку між мікроорганізмами протизапальної та кишкової дії. Також було досліджено механізм протизапальної та бар’єрної репарації MPX у кишкових епітеліальних клітинах, заклавши основу для зменшення використання антибіотиків у тваринництві та птахівництві, це допоможе забезпечити певну теоретичну та практичну цінність для майбутнього застосування MPX для профілактики хвороб тварин та птиці. Наші дослідження виявили, що антимікробні пептиди не тільки знімають запалення кишечника, але й виконують функцію захисту кишкового бар’єру. Дослідження показали, що MPX має високу бактерицидну активність in vitro, і його основним бактерицидним механізмом було створення бактерицидного ефекту шляхом руйнування цілісності мембрани бактеріальної клітини. Даний ефект було доведено в дослідах на білих мишах. MPX ефективний щодо знищення Actinobacillus pleuropneumoniae та полегшення симптомів пневмонії, спричиненої A. pleuropneumoniae, що, головним чином, зменшує рівень факторів запалення з метою полегшення симптомів пневмонії. Крім того, дослідженнями виявлено, що MPX полегшує кишкове запалення та пошкодження бар’єрної функції кишковою паличкою шляхом зменшення факторів запалення та збільшення білків щільного з’єднання. Також було досліджено механізм MPX, який знімає запалення та підтримує функцію кишкового бар’єру в епітеліальних клітинах кишечника. Було доведено зв’язок між дією MPX при зниження рівня запалення та мікроорганізмами кишковика. Цей ефект досягається шляхом заміни патогенної мікрофлори нормальну мікрофлори кишковика. А. pleuropneumoniae є збудником висококонтагіозних та смертельних респіраторних інфекцій, що завдає значних економічних збитків світовій галузі свинарства. Через підвищену резистентність до антибіотиків існує нагальна потреба в пошуку нових альтернативних засобів для лікування інфекцій, викликаних A. pleuropneumoniae. MPX отримують з отрути оси і він впливає на різні бактерії пригнічуючи їх ріст. Дослідженнями було встановлено, що MPX має виражений ефект знищення A.pleuropneumoniae при цьому мінімальна інгібуюча концентрація (MIC) становила 16 мкг/мл. Бактеріальна щільність A. pleuropneumoniae зменшилася в 1000 разів після обробки MPX (1 × MIC) протягом 1 години, при чому на антибактеріальну активність не вплинули pH та температура. Флуоресцентна мікроскопія показала, що MPX (1 × MIC) руйнує мембрану бактеріальної клітини після обробки протягом 0,5 год, підвищуючи проникненість мембрани та вивільняючи бактеріальні білки та Ca2+, Na+ а також інші катіони. Крім того, обробка MPX (1×MIC) значно зменшила утворення бактеріальних біоплівок. Кількісні результати RT-PCR показали, що лікування MPX значно посилювало експресію гена вірулентності PurC і знижувало експресію ApxI, ApxII і Apa1. Крім того, було виявлено, що ген Sap A відіграє важливу роль у переносимості A. pleuropneumoniae до антимікробних пептидів. Терапевтична оцінка на моделях мишей показала, що MPX захищає мишей від смертельної дози A. pleuropneumoniae і знімає запалення легенів. Це свідчить, що MPX можна використовувати для лікування інфекцій викликаних A.pleuropneumonia, це дає підставу для розробки нових ліків для профілактики бактеріальних інфекцій. Escherichia coli — це факультативно-анаеробна бактерія, яка існує в шлунково-кишковому тракті людини і тварин. Ця бактерія може спричинити діарею, ентерит, руйнування кишкового бар’єру та мікроекологічні порушення кишечника. В останні роки через зловживання традиційними антибіотиками з’явилися різноманітні стійкі до ліків штами мікроорганізмів та супербактерії. Тому існує нагальна потреба в пошуку нових альтернатив антибіотикам. В зв’язку з цим було досліджено анитибактеріальний ефект MPX по відношенню до E. coli. Антимікробну дію MPX проти E. coli було виявлено за допомогою МІК, підрахунку чашок, йодиду пропідію, тесту на проникність NPN і DiSC3(5), спостереження під імунофлуоресцентним мікроскопом і впливу стабільності MPX за температурою, pH, іонами. Результати цього дослідження показали, що MPX має виражену антибактеріальну активність проти E. coli, а мінімальна інгібуюча концентрація (MIC) становила 31,25 мкг/мл. Дослідження кінетики бактерицидності MPX довело, що MPX має високу бактерицидну активність протягом 6 годин. Дослідження бактеріальної проникності показали, що MPX може збільшити проникність бактерій, що призведе до збільшення вмісту білка в супернатанті бактерій. Крім того, результати NPN, PI та DiSC3(5) показали, що значення флуоресценції позитивно корелювало з MPX. Тест на стабільність MPX виявив, що іони солі, температура, pH тощо мають незначний вплив на його дію. Крім того, результати скануючої електронної мікроскопії показали, що після дії MPX бактерії різко зменшилися в розмірі та порушилася клітинна оболонка. Отримані результати показали, що MPX має високу бактерицидну активність in vitro, заклавши основу для розробки нових препаратів для лікування бактеріальних інфекцій. Також нами було досліджено, чи був антимікробний пептид мастопаран X (MPX) ефективним проти інфекції E. coli. Використовували мишей BALB/c, інфікованих кишковою паличкою шляхом внутрішньочеревної ін'єкції, що представляло модель сепсису. Терапевтичний ефект MPX оцінювали на моделі мишей, при цьому виявили, що він захищає мишей від смертельної інфекції обумовленою E. coli. Крім того, MPX збільшив довжину ворсинок і зменшив інфільтрацію запальних клітин у тонкій кишці. Аналіз SEM і TEM показав, що MPX ефективно зменшує пошкодження порожньої кишки, викликане E. coli, і збільшує кількість і довжину мікроворсинок. Крім того, MPX знижував експресію IL-2, IL-6, TNF-α, p-p38 і p-p65 у тонкій та товстій кишці. Доведено, що MPX підвищував експресію ZO-1, оклюдину та MUC2 у тонкій та товстій кишці, покращував функцію кишкового бар’єру та сприяв засвоєнню поживних речовин. Це дослідження свідчить про те, що MPX є ефективним терапевтичним засобом для лікування ешерихіозу та інших кишкових захворювань. MPX не виявляв токсичності в клітинах IPEC-J2 і помітно пригнічував індуковані рівні інтерлейкіну-6 (IL-6), фактора некрозу пухлини-альфа (TNF-α), мієлопероксидази (MPO) і лактатдегідрогенази (LDH). Крім того, MPX покращив експресію ZO-1, оклюдину та клаудину та покращив загоєння ран клітин IPEC-J2. Дослідженнями доведено, що антимікробні пептиди можуть регулювати кишкову флору та підтримувати кишковий гомеостаз. Результати досліджень показали, що MPX має високу терапевтичну дію на запалення кишечника, спричинене інфекцією E. coli. Однак зв’язок між зниженням запалення кишечника та кишковою мікробіотою MPX досі невідомий і потребує додаткових досліджень. При проведенні експериментів ми довели кореляцію між протизапальними ефектами MPX і регуляцією кишкової мікробіоти. E. coli використовували для індукції кишкового запалення, і результати показали, що MPX полегшує втрату ваги та кишкові патологічні зміни у зразках аутопсії E. coli. інфікованих мишей. MPX знижував сироваткові рівні пов’язаних із запаленням білків IL-2, IL-6, TNF-α, MPO та LDH на 7 і 28 день. Крім того, результати H&E показали, що MPX збільшив довжину ворсинок і зменшив інфільтрацію запальних клітин тонкої та товстої кишки. Результати SEM і TEM показали, що MPX може покращити морфологію ворсинок тонкої кишки та мікроворсинок і підвищити рівень білка щільного з’єднання. Аналіз секвенування 16S рРНК зразків вмісту сліпої кишки показав, що видова різноманітність мікрофлори були нижче в групі, інфікованій E. coli. На рівнях типу та роду спостерігалася більша чисельність патогенних бактерій Firmicutes, Lachnospiraceae-NK4A-136 та Alistipes. При використанні MPX для лікування дало можливість зменшити кількість патогенних бактерій у групі, інфікованій E. coli. Крім того, MPX збільшив чисельність Muribaculaceae. Альфа- і бета-аналіз показав, що не було суттєвої різниці в структурі бактеріальної асоціації між MPX і контрольними групами. Крім того, зміни в кишковому мікробіомі мишей вплинули на фізіологічні функції та метаболічні шляхи. Загалом це дослідження є першим у дослідженні кореляції впливу MPX на кишкове запалення та кишкову мікробіоту, які знижують кишкове запалення шляхом відновлення різноманітності та функцій кишкової мікробіоти, забезпечуючи новий погляд на лікування бактеріального ентериту. Таким чином, результати цих досліджень довели, що MPX має високу антибактеріальну активність по відношенню до A. pleuropneumoniae та E. coli як in vitro так і in vivo. MPX може профілактувати патологічне запалення легенів і кишечника мишей, а також має лікувальний ефект при пневмоніях, ентеритах, підвищувати кишковий бар’єр у мишей. Дослідженнями доведено, що MPX полегшує запалення кишечника, регулюючи спектр кишкової мікрофлори. За матеріалами дисертації розроблено методичні рекомендації «Профілактика антибіотикорезистентності шляхом застосування антимікробних пептидів», затверджені Вченою радою СНАУ (протокол № 5 від 29.03.2021). Матеріали дисертаційної роботи використовуються при вивченні курсів «Ветеринарна мікробіологія», «Ветеринарна фармакологія» для магістрів факультету ветеринарної медицини Сумського НАУ. А також для курсів «Ветеринарна мікробіологія» та «Ветеринарна фармакологія» для магістрів Хенанського інституту науки та технологій (HIST).

Show full item record