Resistant pumpkin rootstocks and transcriptomic analysis of resistant/susceptible parents in response to fusarium wilt and root-knot nematode

Chen, Rui; Чен, Жуй

Resistant pumpkin rootstocks and transcriptomic analysis of resistant/susceptible parents in response to fusarium wilt and root-knot nematode

Chen, Rui; Чен, Жуй

URI: https://repo.snau.edu.ua/xmlui/handle/123456789/15956

Date: 2026

Abstract:

Research Background. Pumpkin (Cucurbita moschata (Duchesne ex Lam.) Duchesne ex Poir.) is the main rootstock used in grafted cultivation of cucurbit crops. It has the characteristics of well-developed root system, good compatibility, and resistance to soil-borne diseases. With the rapid development of the cucurbit vegetable industry, specialized and intensive cultivation in various regions has caused serious problems of continuous cropping obstacles. Fusarium wilt and root-knot nematode are extremely destructive soil-borne diseases of cucurbits, which can survive in soil for several years and are difficult to eliminate. At present, there is no complete solution. Breeding resistant germplasm resources and rootstocks is the most economical, effective and environmentally friendly measure to control fusarium wilt and Meloidogyne incognita in cucurbits. On this basis, mining resistance genes and analyzing disease resistance mechanisms via transcriptome and bioinformatics are of great significance for accelerating disease-resistant breeding. Scientific Innovation of Research Results. By combining different pumpkin hybrid combinations and pumpkin parents screened under inoculation with fusarium wilt and Meloidogyne incognita, this study identified pumpkin hybrid combinations and parents with resistance to both fusarium wilt and Meloidogyne incognita, namely dual-resistant materials. On this basis, the resistance mechanism and regulatory mechanism of resistant materials to fusarium wilt and Meloidogyne incognita were further revealed. Practical Significance of Research Results. It is recommended to screen resistant resources under separate inoculation of fusarium wilt and Meloidogyne incognita, which is specific and targeted, ensuring the accuracy of evaluation for single resource. It is necessary to conduct comprehensive screening combined with growth and physiological indexes, resistance indexes, antioxidant enzyme activities and other indicators. The results show that a single index cannot accurately reflect the resistance level of different pumpkin hybrid combinations and parents. This study aimed to investigate the resistance of different pumpkin hybrid combinations and parents to fusarium wilt and root-knot nematode under pathogen and nematode infection, and to preliminarily clarify the molecular basis of resistance to fusarium wilt and root-knot nematode in pumpkin using high-throughput transcriptome sequencing to analyze differentially expressed genes. To achieve the above objectives, the following tasks were set: to determine the resistance of different pumpkin hybrid combinations and parents to fusarium wilt under fusarium pathogen infection; to determine the resistance of different pumpkin hybrid combinations and parents to root-knot nematode under root-knot nematode infection; to analyze differentially expressed genes between resistant and susceptible pumpkin parents under fusarium pathogen and root-knot nematode infection, and to understand the resistance mechanism and regulatory mechanism of resistant materials to fusarium wilt and Meloidogyne incognita. The research contents included the resistance of 24 pumpkin hybrid combinations and 12 pumpkin parents to fusarium wilt and root-knot nematode, as well as transcriptome and differentially expressed gene analysis of resistance responses in the resistant parent Hetou a2 and susceptible parent Lingchuan C1. The research object was pumpkin (Cucurbita moschata). The research contents included biological stresses (fusarium pathogen infection, root-knot nematode infection), artificial conditions, and the economic and energy efficiency of pumpkin cultivation in solar greenhouses at Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang City, Henan Province, China. In this study, the adaptation mechanisms of pumpkin materials to biological stresses (fusarium pathogen infection and root-knot nematode infection) were investigated by measuring growth and physiological parameters, antioxidant enzyme activities, malondialdehyde (MDA) content, soluble sugar and soluble protein contents in leaves, stems and roots of seedlings of 24 pumpkin hybrid combinations and 12 pumpkin parents. Pumpkin materials were artificially inoculated with fusarium pathogen at the seedling stage by root-dipping method using a spore suspension of 1×10⁷ spores/mL; a 2nd-stage juvenile suspension of 100 nematodes/mL was collected and inoculated by the root-zone punching method. Root scanning was performed in root trays using a root scanner (EPSON Perfection 4990 PHOTO, Seiko Epson (China) Co., Ltd.). After processing, the scanned root images were analyzed with professional root analysis software (WinRHIZO Pro 2007, March 13, 2007) to obtain parameters such as total root length, total projected area, root surface area, average root diameter, total root volume and number of root tips. The results showed that the tested fusarium pathogen was highly pathogenic, and the symptoms were most significant 20 days after inoculation. Based on growth indexes including plant height, stem diameter and chlorophyll content, hybrid combinations such as 360-3×487 and parents such as Renhe-1, 112-2, Xingtai-23 were less affected by pathogen infection, showing strong resistance to fusarium wilt. Hybrid combination Yanbian-4×041-1 and parents Fangshan, 112-2 exhibited high resistance to root-knot nematode, and their stem diameters were relatively stable under both stresses. Disease resistance was evaluated based on disease index. Moderately fusarium wilt-resistant hybrid combinations including Yanbian-3×360-3, Yanbian-2×041-1 and 360-3×487, and moderately resistant parents such as Renhe-1 and Hetou a2 were screened. Among them, hybrid combination 360-3×487 showed an extremely low stem disease index and outstanding root defense ability. Combined with cluster analysis and membership function value, Yanbian-3×360-3, Yanbian-2×041-1 and 360-3×487 were identified as root-knot nematode-resistant materials, while 112-2 and Lingchuan C1 were identified as susceptible materials. The two evaluation results were basically consistent. Physiological mechanism studies showed that the antioxidant responses of pumpkin to fusarium wilt and root-knot nematode were stress-specific. CAT played a dominant role under fusarium wilt stress, while SOD and CAT were jointly involved in defense against root-knot nematode. MDA content could be used as an important indicator for stress resistance evaluation in pumpkin. Root morphology analysis showed that root-knot nematode significantly induced the proliferation of fine roots and root hairs, enhancing resistance by improving absorption and physical barrier. In contrast, fusarium pathogen mainly infected vascular bundles, leading to declined root function and weak development of fine roots and root hairs. Using the resistant pumpkin parent Hetou a2 and susceptible parent Lingchuan C1 as materials, RNA-seq technology was used to perform treatments of fusarium infection (48 h, 96 h) and root-knot nematode infection (24 h, 48 h). Through transcriptome sequencing and bioinformatics analysis, differentially expressed genes and core metabolic pathways between resistant and susceptible parents were explored, and the early molecular mechanisms of pumpkin in response to two soil-borne diseases were analyzed. The results showed that a total of 254.55 Gb high-quality clean data were obtained, and 33,673 Unigenes were assembled, among which 28,977 were functionally annotated. The data quality and annotation integrity were reliable, laying a solid foundation for subsequent analysis. Differential expression analysis showed that resistant materials significantly up-regulated a large number of defense-related genes at the early stage of stress, while susceptible materials showed extensive down-regulation of genes at the late stage of stress, indicating that resistance differences were closely related to the speed, intensity and stability of stress responses. GO and KEGG enrichment analysis showed that differentially expressed genes were significantly enriched in core defense pathways such as plant-pathogen interaction, MAPK signaling pathway, plant hormone signal transduction, and phenylpropanoid biosynthesis, which were highly conserved under both biological stresses. Expression analysis of the plant-pathogen interaction pathway and key genes showed that resistant materials rapidly activated the overall expression of the pathway. Among them, RBOH showed specifically high expression in disease resistance under both stresses, serving as a key gene for broad-spectrum disease resistance. PR1 and FLS2 exhibited stress-specific response patterns. A total of 33 gene co-expression modules were identified by WGCNA, among which ME17 and ME9 positively and negatively regulated broad-spectrum disease resistance, respectively, and ME20 and ME5 participated in specific stress responses to fusarium wilt and root-knot nematode, respectively. Thirty core hub genes were further screened, and transcription factors such as DOF and ERF were confirmed to form a multi-level disease resistance regulatory network by targeting and regulating the promoter regions of hub genes. Among them, the CmoDof-PMEI core regulatory axis identified in this study showed high reliability through homologous gene function comparison and literature verification, and was a key regulatory unit of the efficient defense system in the Rifu cultivar. In summary, this study revealed the molecular mechanism of broad-spectrum disease resistance in pumpkin through rapid early activation of immune pathways, specific high expression of key genes, and synergistic regulation of multiple modules, providing important gene resources and theoretical basis for molecular breeding of disease resistance in cucurbit crops.

Description:

Історія досліджень. Гарбуз (Cucurbita moschata (Duchesne ex Lam.) Duchesne ex Poir.) є основною підщепою, що використовується у щепленні баштанних культур. Він характеризується добре розвиненою кореневою системою, високою сумісністю та стійкістю до ґрунтових захворювань. Зі стрімким розвитком галузі вирощування баштанних овочів, їх спеціалізоване та інтенсивне вирощування в різних регіонах спричинило серйозні проблеми, пов’язані з неможливістю безперервного вирощування. Фузаріоз та коренева нематода є надзвичайно руйнівними ґрунтовими патогенами баштанних культур, які можуть виживати в ґрунті протягом декількох років і їх важко знищити. Наразі не існує повного вирішення цієї проблеми. Селекція стійких генетичних ресурсів та підщеп є найбільш економічним, ефективним та екологічним заходом боротьби з фузаріозом та Meloidogyne incognita у баштанних культурах. Виходячи з цього, виявлення генів стійкості та аналіз механізмів стійкості до патогенів за допомогою транскриптоміки та біоінформатики мають велике значення для прискорення селекції на стійкість до хвороб. Наукова інноваційність результатів дослідження. Шляхом комбінування різних гібридних комбінацій гарбуза та батьківських сортів, відібраних під час інкубації з фузаріозним в’яненням та Meloidogyne incognita, у цьому дослідженні було виявлено гібридні комбінації гарбуза та батьківські сорти, стійкі як до фузаріозного в’янення, так і до Meloidogyne incognita, а саме матеріали з подвійною стійкістю. На цій основі було додатково з’ясовано механізм стійкості та механізм регуляції стійких матеріалів до фузаріозного в’янення та Meloidogyne incognita. Практичне значення результатів дослідження. Рекомендується проводити скринінг резистентних ресурсів шляхом окремого зараження фузаріозним в’яненням та Meloidogyne incognita, що є специфічним та цілеспрямованим підходом, який забезпечує точність оцінки кожного окремого ресурсу. Необхідно проводити комплексний скринінг у поєднанні з показниками росту та фізіологічними показниками, показниками резистентності, активністю антиоксидантних ферментів та іншими показниками. Результати показують, що окремий показник не може точно відобразити рівень резистентності різних гібридних комбінацій гарбуза та батьківських форм. Метою даного дослідження було вивчення стійкості різних гібридних комбінацій гарбуза та їх батьківських форм до фузаріозного в’янення та кореневих галових нематод в умовах зараження патогенами, а також попереднє з’ясування молекулярних основ стійкості гарбуза до фузаріозного в’янення та кореневих галових нематод за допомогою високопродуктивного секвенування транскриптома для аналізу генів з диференційованою експресією. Для досягнення зазначених цілей було поставлено такі завдання: визначити стійкість різних гібридних комбінацій та батьківських форм гарбуза до фузаріозного в’янення в умовах зараження збудником фузаріозу; визначити стійкість різних гібридних комбінацій та батьківських форм гарбуза до кореневих нематод за умов зараження кореневими нематодами; проаналізувати гени, що диференційно експресуються між стійкими та сприйнятливими батьківськими формами гарбуза за умов зараження фузаріозним в’янення та кореневими нематодами, а також зрозуміти механізм стійкості та механізм регуляції стійких форм до фузаріозного в’янення та Meloidogyne incognita. До змісту дослідження увійшла оцінка стійкості 24 гібридних комбінацій гарбуза та 12 батьківських сортів гарбуза до фузаріозного в’янення та кореневих галових нематод, а також аналіз транскриптома та генів з диференційованою експресією, що визначають реакції на стрес, у стійкого батьківського сорту «Хетоу А2» та сприйнятливого батьківського сорту «Лінчуань С1». Об’єктом дослідження був гарбуз (Cucurbita moschata). Зміст дослідження включав біологічні стреси (інфікування фузаріозним патогеном, інфікування кореневою галовою нематодою), штучні умови, а також економічну та енергоефективність вирощування гарбуза в сонячних теплицях в Інституті науки і технологій Хенань, місто Сіньсян, провінція Хенань, Китай. У цьому дослідженні механізми адаптації матеріалів гарбуза до біологічних стресів (інфікування збудником фузаріозу та інфікування кореневими нематодами) вивчалися шляхом вимірювання показників росту та фізіологічних параметрів, активності антиоксидантних ферментів, вмісту малонового діальдегіду (МДА), розчинних цукрів та розчинних білків у листі, стеблах і коренях саджанців 24 гібридних комбінацій гарбуза та 12 батьківських сортів гарбуза. Матеріал гарбуза штучно інокулювали збудником фузаріозу на стадії саджанців методом занурення коренів, використовуючи суспензію спор у концентрації 1×10⁷ спор/мл; суспензію ювенільних особин 2-го віку у концентрації 100 нематод/мл збирали та інокулювали методом проколювання кореневої зони. Сканування коренів проводили в лотках для коренів за допомогою сканера коренів (EPSON Perfection 4990 PHOTO, Seiko Epson (China) Co., Ltd.). Після обробки відскановані зображення коренів аналізували за допомогою професійного програмного забезпечення для аналізу коренів (WinRHIZO Pro 2007, 13 березня 2007 р.) для отримання таких параметрів, як загальна довжина коренів, загальна проекційна площа, площа поверхні коренів, середній діаметр коренів, загальний об’єм коренів та кількість кінчиків коренів. Результати показали, що досліджуваний збудник фузаріозу був високопатогенним, а симптоми були найбільш вираженими через 20 днів після інокуляції. За показниками росту, такими як висота рослини, діаметр стебла та вміст хлорофілу, гібридні комбінації, зокрема 360-3×487, та батьківські сорти, зокрема Renhe-1, 112-2, Xingtai-23, виявилися менш вразливими до ураження патогенами та продемонстрували високу стійкість до фузаріозного в’янення. Гібридна комбінація Yanbian-4×041-1 та батьківські сорти Fangshan, 112-2 продемонстрували високу стійкість до кореневих нематод, а діаметр їх стебел залишався відносно стабільним за обох стресів. Стійкість до хвороб оцінювали на основі індексу захворюваності. Було відібрано гібридні комбінації з помірною стійкістю до фузаріозного в’янення, зокрема Yanbian-3×360-3, Yanbian-2×041-1 та 360-3×487, а також батьківські сорти з помірною стійкістю, такі як Renhe-1 та Hetou a2. Серед них гібридна комбінація 360-3×487 продемонструвала надзвичайно низький індекс захворюваності стебел та видатну здатність коренів до самозахисту. У поєднанні з кластерним аналізом та значенням функції приналежності Yanbian-3×360-3, Yanbian-2×041-1 та 360-3×487 були визначені як матеріали, стійкі до кореневих нематод, тоді як 112-2 та Lingchuan C1 були визначені як чутливі матеріали. Ці два результати оцінки були в основному узгодженими. Дослідження фізіологічних механізмів показали, що антиоксидантні реакції гарбуза на фузаріозне в’янення та кореневу галову нематоду були специфічними для стресу. CAT відігравав домінуючу роль під час стресу, спричиненого фузаріозним в’яненням, тоді як SOD та CAT спільно брали участь у захисті від кореневої галової нематоди. Вміст MDA можна використовувати як важливий показник для оцінки стресостійкості гарбуза. Аналіз морфології коренів показав, що коренева нематода значно стимулювала проліферацію дрібних коренів та кореневих волосків, підвищуючи стійкість за рахунок поліпшення поглинання та фізичного бар'єру. Натомість збудник фузаріозу в основному уражав судинні пучки, що призводило до зниження функції коренів та слабкого розвитку дрібних коренів і кореневих волосків. Використовуючи резистентний батьківський сорт гарбуза Hetou a2 та сприйнятливий батьківський сорт Lingchuan C1 як вихідний матеріал, за допомогою технології RNA-seq було проведено обробку з інфікуванням фузаріозом (48 год, 96 год) та кореневими галовими нематодами (24 год, 48 год). За допомогою секвенування транскриптома та біоінформаційного аналізу було досліджено гени з диференційованою експресією та основні метаболічні шляхи між резистентними та сприйнятливими батьківськими лініями, а також проаналізовано ранні молекулярні механізми реакції гарбуза на два патогена, що передаються через ґрунт. Результати показали, що загалом було отримано 254,55 Гб високоякісних очищених даних та зібрано 33 673 унігени, серед яких 28 977 були функціонально анотовані. Якість даних та цілісність анотацій були надійними, що заклало міцну основу для подальшого аналізу. Аналіз диференціальної експресії показав, що резистентні матеріали значно підвищували експресію великої кількості генів, пов’язаних із захистом, на ранній стадії стресу, тоді як сприйнятливі матеріали демонстрували значне зниження експресії генів на пізній стадії стресу, що вказує на те, що відмінності в резистентності були тісно пов’язані зі швидкістю, інтенсивністю та стабільністю реакцій на стрес. Аналіз збагачення за методами GO та KEGG показав, що гени з диференційованою експресією були значно збагачені в основних захисних шляхах, таких як взаємодія рослина-патоген, сигнальний шлях MAPK, передача сигналів рослинних гормонів та біосинтез фенілпропаноїдів, які були висококонсервативними за обох видів біологічного стресу. Аналіз експресії шляху взаємодії рослина-патоген та ключових генів показав, що резистентні матеріали швидко активували загальну експресію цього шляху. Серед них RBOH демонстрував особливо високу експресію у стійкості до патогенів за обох стресів, виступаючи ключовим геном для широкого спектру стійкості до патогенів. PR1 та FLS2 виявляли специфічні для стресу партерні реакції. За допомогою WGCNA було ідентифіковано загалом 33 модулі коекспресії генів, серед яких ME17 та ME9 позитивно та негативно регулювали стійкість до широкого спектру захворювань відповідно, а ME20 та ME5 брали участь у специфічних реакціях на стрес, спричинений фузаріозним в’яненням та кореневими нематодами відповідно. Було проведено додатковий скринінг 30 основних генів-хабів, і було підтверджено, що транскрипційні фактори, такі як DOF та ERF, утворюють багаторівневу регуляторну мережу стійкості до хвороб, націлюючись на промоторні ділянки генів-хабів та регулюючи їх. Серед них основна регуляторна вісь CmoDof-PMEI, ідентифікована в цьому дослідженні, продемонструвала високу надійність завдяки порівнянню функцій гомологічних генів та перевірці літературних даних і була ключовою регуляторною одиницею ефективної системи захисту у сорту Rifu. Підсумовуючи, це дослідження дозволило виявити молекулярний механізм широкого спектра стійкості гарбуза до хвороб, що базується на швидкій ранній активації імунних шляхів, специфічній високій експресії ключових генів та синергетичній регуляції численних модулів, що забезпечує важливі генетичні ресурси та теоретичну основу для молекулярної селекції на стійкість до патогенів у баштанних культурах.

Show full item record