Establishment of inflammatory model of bovine mammary epithelial cells induced by lipoteichoic acid

Abstract

The mammary gland of the cow is particularly susceptible to infections of a wide range of pathogenic bacteria, including both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The endotoxins of these pathogenic bacteria include peptidoglycan (PGN), lipoteichoic acid (LTA) and lipopolysaccharide (LPS), and they are the pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) to induce mastitis. Cow mastitis is a detrimental factor in dairy farming industry. Lipoteichoic acid (LTA) is the main component of Staphylococcus aureus cell wall and the key cytotoxic factor causing inflammation. The aims of our work was to establish inflammatory model of study procedures were approved by the Animal Care and Use Committee of the Sumy National Agricultural University, Sumy, Ukraine, and the Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang, China, and performed in accordance with the animal welfare and ethics guidelines. The BMECs harvested from mid-lactation dairy cow milk were isolated by our laboratory. Briefly, the base medium for this cell is DMEM/F-12 (Gibco, USA, cat.12400-024). The complete growth medium included 10% fetal bovine serum (Biological Industries, Israel, cat.04-011-1A/B), DMEM/F-12, and 10 ng/mL epidermal growth factor (Sigma, USA, cat. E4127). Cells were maintained at 37℃in an incubator containing 5% CO2. When cells grew to 80% confluency, the cells were rinsed twice with PBS, and then the primary mammary epithelial cells were trypsinized with 0.25% trypsin plus 0.02% EDTA and passaged. In this study, one inflammatory bovine mammary epithelial cell (BMEC) model was established by infecting the cells with LTA. The BMEC viability induced by LTA were evaluated. The expressions of pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-6) were measured by ELISAand RT- qPCR. The results showed that the treatment of BMECs with LTA at 20 ng/μL for 24 h obviously improved TNF-α and IL-6 protein and gene expression levels. The establishment of the model will play an important role in the screening of anti-inflammatory drugs and the study of the mechanism of action in the future. В роботі викладені результати дослідження встановлення моделі запалення епітеліальних клітин молочної залози корів що індукується ліпотейхоєвою кислотою. Мастит корів є фактором ризику для молочній галузі. До складу клітинної стінки Staphylococcus aureus входять муреїн і ліпотейхоєві кислоти. Ліпотейхоєва кислота (ЛТА) є головним компонентом клітинної стінки золотистого стафілокока та ключовим цитотоксичним фактором, що викликає запалення. Метою роботи було визначити модель запалення епітеліальних клітин молочної залози корів під дією ліпотейхової кислоти золотистого стафілокока. Дослідження проводили в лабораторії безпеки та якості продуктів тваринництва Сумського НАУ, факультету ветеринарної медицини, Суми, Україна та на базі Науково-технічного інституту Хенань, Сіньсян, Китай. Дослідження були проведені згідно вимог Комітету з питань біоетики та виконувались відповідно до керівних принципів добробуту та етики тварин. Були відібрані зразки коров’ячого молока середнього періоду лактації, де лабораторно виділяли ЕКМЗ. Для дослідження використовували метод імуноферментного аналізу та ПЛР діагностику. Проводили аналіз клітин з використанням ПЛР у реальному часі (RTCA) для виявлення впливу різних концентрацій (0, 10, 20, 40, 80 нг / мкл) ліпотейхової кислоти (LTA) на проліферацію ЕКМЗ. Результати ІФА та qRT-PCR показали, що обробка епітеліальних клітин молочної залози великої рогатої худоби 20 нг / мкл LTA протягом 24 годин може значно підвищити рівень експресії білка та генів TNF-α та IL-6. Створення цієї моделі може зіграти важливу роль у скринінгу протизапальних препаратів та вивченні механізму дії в майбутньому.